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產(chǎn)氣莢膜梭菌及檢驗

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-09-01
核心提示: 一、流行病學(xué)  產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧芽胞菌,是引起食源性胃腸炎最常見(jiàn)的病原之一?梢鸬湫偷氖澄镏卸、爆發(fā)。由

一、流行病學(xué)

  產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧芽胞菌,是引起食源性胃腸炎最常見(jiàn)的病原之一?梢鸬湫偷氖澄镏卸、爆發(fā)。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病為魏氏梭菌中毒;颊吲R床特征是劇烈腹絞痛和腹瀉。攝食被本菌污染的食品后8�22小時(shí)開(kāi)始發(fā)病。在食品中該菌數量必須達到很高時(shí)(1.0×107或更多),才能在腸道中生產(chǎn)毒素,病程通常在24小時(shí)內,但某些個(gè)體的不顯著(zhù)癥狀可能會(huì )持續1�2周,已報導有少數病人因脫水和其它混合感染而導致死亡。

  據美國人類(lèi)衛生教育福利部報導魏氏梭菌引起的食物中毒,在美國占細菌性食物中毒的30%左右,另?yè)绹膊】刂浦行,估計每年因產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒約近1萬(wàn)人,其中大約只報導1200例,暴發(fā)約20起,大量的暴發(fā)和少量的發(fā)病都與公共飲食有關(guān)。例如:學(xué)校的自助食堂和護理病房,產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒最常發(fā)生于兒童和老人。

  產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于環(huán)境中,經(jīng)常在人和許多家養及野生動(dòng)物的腸道中發(fā)現該細菌的芽胞長(cháng)期存在于土壤和沉淀物中,從牛肉、豬肉、羔羊、雞、火雞、燜肉、紅燒蔬菜,燉肉和肉汁中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌,引起食物中毒的食品大多是畜禽肉類(lèi)和魚(yú)類(lèi)食物,牛奶也可因污染而引起中毒,原因是因為食品加熱不徹底,使芽胞在食品中大量繁殖所致,此外不少熟食品,由于加溫不夠或后污染而在緩慢的冷卻過(guò)程中,細菌繁殖體大量繁殖并形成芽胞產(chǎn)生腸毒素,其食品并不一定在色味上發(fā)現明顯的變化,人們在誤食了這樣的熟肉或湯菜,就有可能發(fā)病。

  產(chǎn)氣莢膜梭菌易于形成芽胞,芽胞的熱抵抗力很強,由患者糞便中分離的芽胞能耐受100℃,1�5小時(shí)的加熱。除了具有形成芽胞及耐熱等特點(diǎn)之外,生化性狀,毒素及酶的特異性等,同其它魏氏梭菌是一致的。

  當產(chǎn)品達到合適溫度時(shí),那些未被殺死的芽胞,由于蒸煮而使其可能發(fā)芽。蒸煮后需要經(jīng)過(guò)快速一致的冷卻。事實(shí)上在所有暴發(fā)的病例中,產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒的主要原因是沒(méi)有經(jīng)過(guò)恰當冷卻事先煮好的食品,特別當做好的食品量又是很大時(shí),適當的熱處理(60℃以上)充分的再加熱,冷卻食品(最低中心溫度為24℃)也是必要的控制措施,培訓食品加工人員,仍是控制措施的一個(gè)關(guān)鍵方面。

二、生物學(xué)特性:

1、形態(tài):

  本菌菌體兩端鈍圓,直桿狀1-2×2-10μm,革蘭氏陽(yáng)性,卵圓形芽胞位于菌體中央或近端,不比菌體明顯膨大,但有些菌株在一般的培養條件下很難形成芽胞,無(wú)鞭毛,在人和動(dòng)物活體組織內或在含血清的培養基內生長(cháng)時(shí)有可能形成莢膜。

2、培養:

  本菌雖屬厭氧性細菌,但對厭氧程度的要求并不太嚴,甚至在EH=200-250mv的環(huán)境內也能生長(cháng)。

  在普通培養基上能生長(cháng),若加葡萄糖,血液,則生長(cháng)更好。生長(cháng)適宜溫度為37-47℃,多認為43-47℃為最宜本菌生長(cháng)和繁殖速度極快,在適宜條件下增代時(shí)間僅8min,可利用高溫快速培養法,對本菌進(jìn)行選擇分離,如在45℃下,每培養3-4小時(shí)傳種1次,即可較易獲得純培養,在深層葡萄糖瓊脂中大量產(chǎn)氣,致使瓊脂破碎,在牛奶培養基中,可見(jiàn)到暴裂發(fā)酵,在庖肉培養基中培養數小時(shí)即可見(jiàn)到生長(cháng),產(chǎn)生大量氣體,肉渣或肉塊變?yōu)槁詭Х凵,但不被消化?/p>

  在普通瓊脂平板上培養15小時(shí)左右可見(jiàn)到菌落,培養24小時(shí)菌落直徑2�4mm,呈凸面狀,表面光滑半透明,正圓形,在營(yíng)養成分不足或瓊脂濃度高的平板上,有時(shí)尤其經(jīng)過(guò)傳種的菌株,可能形成鋸齒狀邊緣或帶放射狀條紋的R型菌落。

  在含人血、兔血或綿羊血的瓊脂平板上培養的菌落周?chē)须p層溶血環(huán),內層溶血完全,外層溶血不完全,好似靶狀。

  在乳糖、牛奶、卵黃瓊脂平板上培養的菌落周?chē)霈F乳光渾濁帶。此反應能被本菌α抗毒素抑制。由于發(fā)酵乳糖菌落周?chē)呐囵B基顏色發(fā)生變化(中性紅指示劑呈粉紅色)不消化牛奶,不分解游離脂肪,菌落周?chē)怀霈F透明環(huán)及虹彩層。

3、生化特性:

  所有菌株均發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖,產(chǎn)酸產(chǎn)氣,液化明膠,不產(chǎn)生靛基質(zhì),還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,但也有例外。能將亞硫酸鹽還原為硫化物。在含亞硫酸鹽及鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落。發(fā)酵牛奶中的乳糖、牛奶酸凝固,同時(shí)由于大量產(chǎn)氣凝塊碎裂,所謂暴力發(fā)酵,這是本菌的主要生化特征之一,也是主要鑒別的指標。G+C克分子百分比為24-27%。

  產(chǎn)生卵磷脂酶(磷酸酶C)分解卵磷脂為磷酰膽堿與非水溶性甘油二酸酯,上述卵黃瓊脂平板菌落周?chē)霈F的乳光渾濁帶即屬本反應。

4、毒素:

  (1)、外毒素:各型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的外毒素(或可溶血抗原)共有12種,其中主要有4型,即A、B、C、D.而已知〝A型〞毒素與人類(lèi)食物中毒有關(guān)。

  (2)、腸毒素:A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐熱株能引起人的食物中毒,關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌食物中毒的發(fā)病機制,基本認為是,被耐熱性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞污染的肉、禽等生食品,雖經(jīng)烹制加熱,但芽胞不僅不死滅,反而由于受到〝熱刺激〞,在較高溫度長(cháng)時(shí)間儲存(即緩時(shí)冷卻)的過(guò)程中芽胞發(fā)芽,生長(cháng),繁殖,而且隨食物進(jìn)入人腸道的這些繁殖體容易再形成芽胞,同時(shí)產(chǎn)生腸毒素,聚集于芽胞內,當菌體細胞自溶和芽胞游離時(shí),腸毒素將被釋放出來(lái),人、猴、狗等口服人工提取的該腸毒素能引起腹瀉。

  人和動(dòng)物對產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素的免疫主要表現為抗腸毒素的產(chǎn)生,健康者血清常含有抗腸毒素,似乎表明產(chǎn)氣莢膜梭菌作為正常菌群,在腸道內可能在不斷地產(chǎn)生著(zhù)腸毒素。

三、檢驗方法:

1、樣品的儲存和運送:

  如樣品不能立即進(jìn)行檢驗時(shí),應在樣品中加等量緩沖甘油--氯化鈉溶液(液體食品應加雙料的),將樣品做低溫保存,直到檢驗,運送樣品時(shí),應使樣品保持冷凍狀態(tài),并要避免容器消損。

2、將解凍樣品取25g移入滅菌的均質(zhì)杯,并加入0.1%蛋白胨水225mL,低速攪拌1-2分鐘,使之均質(zhì)化,作為1:10稀釋液,以上1:10稀釋的均質(zhì)液,按1mL加入0.1%蛋白胨水9mL,作做成10-2--10-6的系列稀釋液,(如為液體樣品則可吸取25mL加入盛有225mL稀釋劑的500mL稀釋并搖勻,再作10倍遞增稀釋即可)。

  傾注不含卵黃的TSC瓊脂倒10個(gè)滅菌平皿中,每皿約5mL,并迅速旋轉平皿,使瓊脂凝固后,將每個(gè)平皿編號標記,以無(wú)菌操作,吸取稀釋樣品1mL分別加到每個(gè)瓊脂平板表面中心,再向平皿傾注不含卵黃的TSC瓊脂15mL,緩慢地旋轉平皿,使其與接種物混合均勻.也可用滅菌L棒,將0.1mL樣品稀釋液均勻地涂布于不含卵黃乳液的TSC瓊脂上,將平板水平靜置5-10分鐘,使接種物被吸收,然后用不含卵黃的TSC瓊脂10mL覆蓋平板表層,瓊脂凝固后,將平板置于厭氧罐內于36+1℃,培養20小時(shí),取出平板,用肉眼觀(guān)察生長(cháng)情況和有無(wú)黑色菌落,挑選有20-200個(gè)黑色菌落的平板進(jìn)行記數,產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落一般呈黑色。

3、證實(shí):

  從可記數的平板(具20-200個(gè)菌落)中挑選10個(gè)典型菌落,分別接種到液體硫乙醇酸鈉培養基試管中,于36±1℃,培養18-24小時(shí),取培養物涂片,作革蘭氏染色鏡檢,檢查培養物的純度和細菌形態(tài),產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽(yáng)性,粗短的梭狀芽胞桿菌.對于被污染的培養物可劃線(xiàn)接種在含有卵黃的TSC瓊脂平板上,于厭氧條件下以36±1℃,24小時(shí)培養,以獲得純培養物。

  上述培養物,以接種針穿刺接種動(dòng)力,硝酸鹽培養基36±1℃厭氧培養24小時(shí)觀(guān)察有無(wú)動(dòng)力,滴加甲萘胺液和對氨基苯磺酸液各0.5mL,觀(guān)察硝酸鹽是否被還原,取生長(cháng)旺盛的硫乙醇酸鈉培養液1mL接種含鐵牛奶培養基,厭氧培養過(guò)夜或46℃2-5小時(shí)觀(guān)察有無(wú)暴烈發(fā)酵現象,但培養基不變黑,將培養液點(diǎn)種卵黃瓊脂平板(每個(gè)平板至少可點(diǎn)種10點(diǎn)),倒置厭氧培養裝置內36±1℃培養24小時(shí),觀(guān)察接種點(diǎn),產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶,分解卵黃中的卵磷脂,使接種點(diǎn)的底部及周?chē)纬扇榘咨臏啙釒?此外還可作明膠液化及含1%水楊甙和含1%棉子糖的發(fā)酵試驗等,對上述四項主要生化試驗,全部符合者即可確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

4、結果解釋及報告:

  樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的計算,基于被證實(shí)為產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落的百分數(例如10‐4稀釋的平板中,平均有85個(gè)菌落,10個(gè)菌落中,有8個(gè)被證實(shí)為產(chǎn)氣莢膜梭菌,那么每1g食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌數即為85×(8/10)×10000=680000),報告產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌數/g(mL) 。

 

產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗檢測程序

檢樣25g(mL)或稀釋液225mL

TSC瓊脂混合傾注

黑色菌落記數

任挑黑色菌落10個(gè),分別接種FT培養基

確證試驗

 

鏡 動(dòng) 銷(xiāo) 牛 卵

檢 力 酸 奶 磷

形 試 鹽 發(fā) 脂

態(tài) 驗 還 酵 分

  原  

菌落計數

 

四、培養過(guò)程中芽胞形成和腸毒素的產(chǎn)生:

  假如對分離的菌株,直接測試芽胞和腸毒素,應在硫乙醇酸鹽肉湯中繼續培養,如上述,將儲存培養物移至其它實(shí)驗室作測試時(shí),必須先將其移種至Difco公司生產(chǎn)的熟肉培養基中,并于35℃培養24小時(shí),然后再置于室溫中24小時(shí),并將此熟肉培養物放置在4℃保存。

  用旋轉混合熟肉培養物,并分別各移種0.5mL至2支含10mL新鮮經(jīng)殺菌的液體硫乙醇酸鹽培養基中,將其中1管置于有水的燒杯中,或在水浴中加熱75℃10分鐘,于35℃培養18小時(shí),另外1管在35℃培養4小時(shí),并將此培養物接種改良AE芽胞形成培養基中,最好用0.75mL經(jīng)4小時(shí)培養的硫乙醇酸鹽的培養基,接種到芽胞肉湯中,于35℃厭氧罐中,培養18-24小時(shí)。

  核對培養結果,用相差顯微鏡觀(guān)察芽胞或作涂片染色鏡檢,顯微鏡視野中少于5個(gè)芽胞的認為芽胞形成不良。

  將芽胞形成培養物用10000×g轉速15分鐘離心,并將無(wú)細胞的芽胞培養物,以反向乳凝試劑盒,檢測腸毒素。

五、控制:

  適宜的冷卻處理和再加熱,食品加工人員的教育。 當產(chǎn)品達到合適溫度時(shí),那些未被殺死的芽胞可能發(fā)芽。蒸煮后需要經(jīng)過(guò)快速統一的冷卻,事實(shí)上在所有的爆發(fā)病例中,產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒的主要原因是沒(méi)有經(jīng)過(guò)恰當冷卻事先煮好的食品,特別當食品量又是很大時(shí)。適當的熱處理,充分的再加熱,冷卻食品,也是必要的控制措施。食品加工人員的教育仍是控制的一個(gè)關(guān)鍵方面。


編輯:foodadmin

 
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