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出血性大腸菌及檢驗

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-05-11
核心提示:一、概況  腸出血性大腸桿菌(EHEC)是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O157:H7血清型為代表菌株!

一、概況

  腸出血性大腸桿菌(EHEC)是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O157:H7血清型為代表菌株。

  腸出血性大腸桿菌感染可引起輕度腹瀉、出血性結腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合癥(HUS),血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等。其中HUS病程兇險,易造成急性腎衰竭乃至死亡。

  1982年美國首次報道了由EHEC O157:H7引起的出血性腸炎暴發(fā)。此后,世界各地陸續報道了該菌引起的感染,并有上升趨勢。1996年在日本發(fā)生的EHEC O157:H7的暴發(fā)流行,引起出血性腹瀉,先后波及30多個(gè)都、府、縣,感染近萬(wàn)人,并造成12人死亡,引起了全世界的關(guān)注。此外,美國、加拿大、瑞典、澳大利亞、英國的蘇格蘭和威爾士等國家和地區也相繼報道了EHEC的散發(fā)性感染和暴發(fā)流行。日本、加拿大及瑞士等國已將EHEC O157:H7列為必須報告的傳染病,予以高度重視。我國于1988年首次分離到EHEC O157:H7,從已有的流行病調查資料來(lái)看,我國亦存在EHEC的散發(fā)病例,但尚未有暴發(fā)流行的報道。

二、流行病學(xué)

  EHEC O157:H7引起的感染有明顯的季節性,多發(fā)生于夏秋兩季,7-8月為發(fā)病高峰。在地區分布上,多發(fā)生于發(fā)達國家,主要以散發(fā)性感染為主。在年齡分布上,兒童與老年人的發(fā)病率明顯高于其他年齡組,且并發(fā)HUS和TTP的機率較高。最易分離到 O157:H7的年齡為5-9歲(0.9%)和50-59歲(0.89%)。農場(chǎng)動(dòng)物,尤其是反芻動(dòng)物,構成EHEC O157:H7在世界范圍內的主要貯存宿主。O157:H7在牛中的流行報告范圍為0.1-16%;羊、豬、雞、馬、鹿、鴿子、海鷗等動(dòng)物均可能為EHEC的攜帶者。EHEC的感染可形成直接傳播(動(dòng)物→人,人→人),也可以通過(guò)間接傳播(食物、水源→人)。食源性的EHEC感染中,牛肉、生奶、雞肉及其制品,蔬菜、水果及其制品等均可能受其污染。其中, 牛肉是最主要的傳播載體。

  EHEC O157:H7的感染劑量極低。潛伏期為3-10天,病程2-9天。通常是突然發(fā)生劇烈腹痛和水樣腹瀉,數天后出現出血性腹瀉,可發(fā)熱或不發(fā)熱。部分患者可發(fā)展為HUS、TTP等, 嚴重者可導致死亡。

三、生物學(xué)特征

  EHEC O157:H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性,無(wú)芽胞,有鞭毛,動(dòng)力試驗呈陽(yáng)性。其鞭毛抗原可丟失,動(dòng)力試驗陰性,即O157:NM。EHEC O157:H7具有較強的耐酸性,pH2.5-3.0,37℃可耐受5小時(shí);耐低溫,能在冰箱內長(cháng)期生存;在自然界的水中可存活數周至數月;不耐熱,75℃ 1分鐘即被滅活;對氯敏感,被1mg/L的余氯濃度殺滅。EHEC 的最適生長(cháng)溫度為33-42℃,37℃繁殖迅速,44-45℃生長(cháng)不良,45.5℃停止生長(cháng)。

  EHEC O157:H7除不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇外,其他常見(jiàn)的生化特征與大腸埃希氏菌 基本相似,但也有某些生化反應不完全一致,具有鑒別意義(詳見(jiàn)表2)。EHEC O157:H7雖然有uidA基因,但其編碼的β-葡萄糖醛酸酶無(wú)活性,不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)產(chǎn)生熒光,即MUG陰性。

  EHEC除其代表菌株O157:H7外,還包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清學(xué)鑒定包括O抗原和H抗原的鑒定。前者可使用玻片凝集試驗或膠乳凝集試驗;后者則應先進(jìn)行動(dòng)力試驗,動(dòng)力活潑者再進(jìn)行玻片和試管凝集試驗。

  EHEC O157:H7的另一個(gè)顯著(zhù)特征是可產(chǎn)生大量的Vero毒素(VT),也稱(chēng)作類(lèi)志賀氏毒素(SLT),是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分為VT1和VT2。該毒素有一個(gè)A亞單位和5~6個(gè)B亞單位組成。B亞單位與宿主腸壁細胞糖脂受體結合,具有毒素活性的A亞單位進(jìn)入細胞,改變60s核糖體的組分,干擾蛋白質(zhì)的合成。編碼VT的基因位于噬菌體上,可缺失而不產(chǎn)生VT。

四、EHEC O157:H7的檢驗

1、培養基制備:

  改良EC新生霉素增菌肉湯 (mEC)

  EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過(guò)濾除菌的新生霉素,使終濃度為20μg/mL。

  改良山梨醇麥康凱瓊脂(TC-SMAC)

  山梨醇麥康凱瓊脂加入過(guò)濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液,使終濃度2.5mg/L,頭孢克污,使終濃度為0.05mg/L。

  MUG-LST肉湯

  LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG),使終濃度為0.1g/L。

2、增菌培養

  秤取25克樣品放入225mL mEC中,均質(zhì)。于41±1℃培養18-24小時(shí)。

3、分離

  將mEC肉湯培養物10倍遞增稀釋。從10-4,10-5,10-6稀釋度,各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培養18~24小時(shí)?梢 EHEC O157:H7菌落扁平,透明或半透明,邊緣光滑,呈淡褐色中心,直徑約2mm。

4、鑒定

  挑取TC-SMAC上的可疑菌落,接種MUG-LST,于36±1℃培養18~24小時(shí),出現產(chǎn)氣,且無(wú)熒光者,分離到普通營(yíng)養瓊脂。

  對純菌落用EHEC O157:H7標準血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗,必要時(shí)進(jìn)行生化試驗。

  在檢測過(guò)程中,也可以在選擇性增菌后,取出5mL增菌液,經(jīng)100℃水浴15分鐘滅活后,供自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫測試(VIDAS),迅速獲得初步結果,陽(yáng)性反應者需作進(jìn)一步證實(shí)。

  EHEC O157:H7檢驗程序圖解

檢樣25g

      mEC225mL → VIDAS快速篩選

  ↓41±1℃,18-24h

10-4,10-5,10-6稀釋度涂布TC-SMAC

↓36±1℃,18-24h

挑取5-10個(gè)可疑菌落接種MUG-LST

↓36±1℃,18-24h

MUG陰性培養物轉種普通營(yíng)養瓊脂

↓     ↓

生化反應鑒定    血清凝集鑒定

       或

         膠乳凝集試驗

  用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落,經(jīng)抗E.coli O157:H7標準血清或EHEC O157:H7膠乳凝集測試為陽(yáng)性者,報告檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7。

  如需要進(jìn)一步檢測Vero毒素基因的存在,可通過(guò)接種Vero細胞或Hela細胞,觀(guān)察細胞病變進(jìn)行判定,或可使用基因探針檢測和聚合酶鏈反應(PCR)檢測法。(參見(jiàn)FDA細菌分析手冊第8版)

表1:EHEC O157:H7部分生化反應特性

靛基質(zhì)(吲哚)試驗

陽(yáng)性

MR-VP試驗

MR陽(yáng)性 VP陰性

枸櫞酸鹽利用試驗

陰性

氧化酶試驗

陰性

三糖鐵瓊脂

底及斜面黃色,H2S-

纖維二糖發(fā)酵

陰性

山梨醇發(fā)酵

陰性或遲緩發(fā)酵

賴(lài)氨酸脫羧酶

陽(yáng)性(紫色)

鳥(niǎo)氨酸脫羧酶

陽(yáng)性(紫色)

棉子糖發(fā)酵

陽(yáng)性

衛矛醇發(fā)酵

陽(yáng)性

西蒙氏檸檬酸鹽

陰性

鼠李糖發(fā)酵

陽(yáng)性

MUG試驗

陰性

動(dòng)力試驗

有動(dòng)力或無(wú)動(dòng)力

 

表2: EHEC O157:H7與大腸埃希氏菌有鑒別意義的生化特性

試驗項目

E.coliO157:H7

(174株)%

大腸埃希氏菌

(974株)%

(1887株)%

MUG

0

96

NT

山梨醇

0

95

80

棉子糖

100

20

49

衛矛醇

100

50

49

賴(lài)氨酸

100

92

81

鳥(niǎo)氨酸

100

74

58

 

[注] NT為未檢測,表內數字為陽(yáng)性率。

五、控制

  適宜的蒸煮,適當的儲存溫度,個(gè)人衛生教育,防止糞便污染動(dòng)物胴體是控制出血性大腸桿菌污染的主要措施。

編輯:foodadmin

 
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