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大腸桿菌的檢驗方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-05-13
核心提示:    SN 0169-1992 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法    GB/T 4789.6-2003 食品衛生微生物學(xué)檢驗 致瀉

    SN 0169-1992 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法

    GB/T 4789.6-2003 食品衛生微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗

    GB/T 4789.6-1994 食品衛生微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(已經(jīng)作廢)

以SN標準方法為例,進(jìn)行說(shuō)明。

樣品制備:
  以無(wú)菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內,于8000 r/min均質(zhì)1~2min,制成1:10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。
  稀釋樣品勻液根據對樣品污染情況的估計,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如10**-2、10**-3、10**-4……。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過(guò)程不得超過(guò)15min。

  附:這是一種9管MPN法測定方法,什么是MPN法?

LST和EC初步篩選:
  對每個(gè)樣品,選擇適宜的三個(gè)連續稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯,每管接種1mL。將接種管置于36±1℃培養48±2h。

  觀(guān)察試管的產(chǎn)氣情況:檢查倒管內是否有氣泡產(chǎn)生,用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內產(chǎn)氣的LST肉湯管培養物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內,培養48±2h。

  附:LST肉湯、EC肉湯有些什么?

EMB平板:

  取其產(chǎn)氣管的培養物劃線(xiàn)接種于伊紅美藍(EMB)平板,36±1℃培養24±2h。

  檢查平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。

  如有典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落;如無(wú)典型菌落,則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營(yíng)養瓊脂斜面上,36±1℃培養18~24h。

  附:怎樣進(jìn)行平板劃線(xiàn)分離?

    平板劃線(xiàn)示例

    EMB平板原理及照片

生化試驗:
  將斜面培養物移種到下列培養基中進(jìn)行生化試驗! 
  1 色氨酸肉湯在36±1℃培養24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2~0.3mL,上層出現紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應。

  附:靛基質(zhì)試驗原理及照片


  2 MR-VP培養基:在36±1℃培養48±2h。以無(wú)菌操作移取培養物1 mL至13mm×100mm試管中,加5%α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40%氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶,振搖試管后靜置2h,如出現伊紅色,為VP試驗陽(yáng)性。
  將MR-VP培養物的剩余部分再培養48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養物變紅色,為甲基紅試驗陽(yáng)性,若變黃色則為陰性反應。

  附:MR-VP試驗原理及照片


  3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯:
于36±1℃培養96h記錄有無(wú)生長(cháng)。

  附:枸椽酸鹽利用試驗原理及斜面顯色照片


  4 LST肉湯于36±1℃培養48±2h,觀(guān)察試管中是否產(chǎn)氣。
  5 革蘭氏染色:取18h營(yíng)養瓊脂斜面培養物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下:


━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
  靛 基 質(zhì)┃   MR   ┃   VP   ┃  枸椽酸鹽 ┃ 鑒定(型別)
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
   。々А  +   ┃  。   ┃ 。    ┃典型大腸桿菌
   。々  。  ┃  。   ┃ 。    ┃非典型大腸桿菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
   。々А  +   ┃   -   ┃ 。    ┃典型中間型
   。々А  +   ┃  。   ┃ 。   ┃非典型中間型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
   。々А  -   ┃   +   ┃  +    ┃典型產(chǎn)氣腸桿菌
   。々А  -   ┃  。   ┃ 。    ┃非典型產(chǎn)氣腸桿菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
  如出現上表以外的生化反應類(lèi)型,表明培養物可能不純,應重新劃線(xiàn)分離,必要時(shí)做
重復試驗。

結果報告:

  大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC試驗為++--或-+--,再根據LST肉湯陽(yáng)性管數查MPN表,報告每克(毫升)樣品中大腸桿菌MPN值。

編輯:foodyy

 
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