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新型蛋白質(zhì)結構分析手段-氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)展

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2012-03-13  來(lái)源:沃特世科技(上海)有限公司實(shí)驗中心
核心提示: 新型蛋白質(zhì)結構分析手段-氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)展

氫氘交換質(zhì)譜法是一種研究蛋白質(zhì)空間構象的質(zhì)譜技術(shù)。它在蛋白質(zhì)結構及動(dòng)態(tài)變化研究、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)發(fā)現、蛋白表位及活性位點(diǎn)鑒定方面有著(zhù)廣泛的應用。隨著(zhù)氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展,它正在成為結構生物學(xué)家及生物藥物研發(fā)的重要手段。
 
氫氘交換質(zhì)譜(HDX MS,hydrogen deuterium exchange mass spectrometry)是一種研究蛋白質(zhì)空間構象的質(zhì)譜技術(shù)。其原理是將蛋白浸入重水溶液中,蛋白的氫原子將于重水的氘原子發(fā)生交換,而且蛋白質(zhì)表面與重水密切接觸的氫比位于蛋白質(zhì)內部的或參與氫鍵形成的氫的交換速率快,進(jìn)而通過(guò)質(zhì)譜檢測確定蛋白質(zhì)不同序列片段的氫氘交換速率,從而得出蛋白質(zhì)空間結構信息[1]。這個(gè)過(guò)程就像將握著(zhù)的拳頭浸入水中,然后提出水面并張開(kāi)手掌。這時(shí),濕潤的手背表明它在“拳頭”的結構中處于外表面,而較為干燥的手心表明它是“拳頭”的內部。除樣品制備外,氫氘交換質(zhì)譜法的主要過(guò)程包括:交換反應、終止反應、將蛋白快速酶切為多肽、液相分離、質(zhì)譜檢測、數據解析。其中交換步驟需要在多個(gè)反應時(shí)長(cháng)下進(jìn)行,如0s、10s、1min、10min、60min等,以繪制交換率曲線(xiàn),得到準確全面的信息。氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結構及其動(dòng)態(tài)變化研究[1]、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)發(fā)現[2]、蛋白表位及活性位點(diǎn)鑒定方面有著(zhù)廣泛的應用[3]。
 
與經(jīng)典的蛋白質(zhì)結構研究方法相比,如X射線(xiàn)晶體衍射(X-Ray Crystallography)和核磁共振(NMR. Nuclear Magnetic Resonance)等方法,氫氘交換質(zhì)譜不能夠提供精確的蛋白空間結構,它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白質(zhì)空間結構的表面位置(包括動(dòng)態(tài)變化中的)、可能的活性位點(diǎn)和蛋白-蛋白相互作用位點(diǎn)等。但是氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)有著(zhù)其他經(jīng)典方法不具備的優(yōu)點(diǎn):首先,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)結構動(dòng)態(tài)變化的研究是氫氘交換質(zhì)譜的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn),包括變化中的活性位點(diǎn)及表位;其次,氫氘交換質(zhì)譜在蛋白復合體構象的研究中也具有獨到的優(yōu)勢;此外,氫氘交換質(zhì)譜還具有對樣品需求量小、純度要求相對較低、研究對象為溶液環(huán)境下的蛋白質(zhì)的天然構象而非晶體中構象等優(yōu)勢[1,4,5]。自1991年第一篇研究論文發(fā)表起,氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)不斷發(fā)展,已經(jīng)成為結構生物學(xué)及質(zhì)譜技術(shù)中一個(gè)非常重要的應用領(lǐng)域[6]。但是氫氘交換質(zhì)譜實(shí)驗的復雜的實(shí)現過(guò)程在一定程度上影響了其應用的廣泛度。主要的難點(diǎn)有:1、如何避免交換后氘代肽段的回交現象;2、實(shí)驗控制的高精確性和重現性要求;3、交換后造成的疊加的質(zhì)譜峰如何準確分辨;4、簡(jiǎn)易高效的分析軟件需求;5、以氨基酸為單位的交換位點(diǎn)辨析。沃特世公司自2005年起,針對以上難點(diǎn)不斷進(jìn)行攻關(guān),推出了目前唯一商業(yè)化的全自動(dòng)氫氘交換質(zhì)譜系統解決方案--nanoACQUITY UPLC? HD-Exchange System(圖1)。在全世界范圍內,這套系統已經(jīng)幫助科學(xué)家在包括Cell、Nature等頂級研究期刊中發(fā)表研究論文[7,8]。除科研需求外,沃特世氫氘交換質(zhì)譜系統也受到眾多國際領(lǐng)先制藥公司的認可,并用于新藥開(kāi)發(fā)中蛋白藥物活性位點(diǎn)及表位的研究工作中。


 
氫氘交換實(shí)驗中的回交現象將嚴重影響實(shí)驗數據的可信度,甚至導致錯誤結果的產(chǎn)生。要避免回交需要做到兩點(diǎn):盡量縮短液質(zhì)分析時(shí)間和保證液質(zhì)分析中的溫度和pH為最低回交反應系數所要求的環(huán)境。沃特世UPLC?系統采用亞二納米色譜顆粒填料,較HPLC使用的大顆粒填料,UPLC具有無(wú)與倫比的分離度。因此UPLC可以做到在不損失色譜分離效果的要求下,極大縮短液相分析時(shí)間的要求[9]。對于對溫度和pH控制問(wèn)題,在多年的工程學(xué)改進(jìn)中,nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已經(jīng)實(shí)現了對酶切、液相分離等步驟的全程控制[10]。
 
對氫氘交換質(zhì)譜實(shí)驗精確性和重現性的要求是其應用的第二個(gè)主要難點(diǎn)。在實(shí)驗中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數據。如果進(jìn)行人工手動(dòng)實(shí)驗,很難做到對10S-10min等幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的精確操作。再考慮到重復實(shí)驗的需求,人工手動(dòng)操作會(huì )對最終數據可信度產(chǎn)生影響。而且實(shí)驗過(guò)程重復繁瑣,將給實(shí)驗人員帶來(lái)非常大的工作壓力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通過(guò)智能機械臂,精確完成交換、終止交換、進(jìn)樣、酶切等一系列實(shí)驗過(guò)程,而且始終保證各個(gè)步驟所需不同的溫度環(huán)境。這些自動(dòng)化過(guò)程不但保證了實(shí)驗數據的可靠性,提高了實(shí)驗效率,也將科學(xué)家從繁瑣的重復實(shí)驗中解放出來(lái)。
 
氫氘交換實(shí)驗的質(zhì)譜數據中,隨著(zhù)交換時(shí)間的延長(cháng),發(fā)生了交換反應的多肽,由于質(zhì)量變大,其質(zhì)譜信號將逐漸向高質(zhì)荷比方向移動(dòng)。因此,這些質(zhì)譜峰可能與哪些未發(fā)生交換反應的多肽質(zhì)譜峰逐漸疊加、相互覆蓋。相互疊加的質(zhì)譜信號,不但影響對峰歸屬的判斷,更會(huì )增加交換率數據的誤差。因為交換率判斷需要通過(guò)對發(fā)生交換的多肽進(jìn)行定量,毫無(wú)疑問(wèn)因疊加的而混亂的質(zhì)譜數據將極大的影響對質(zhì)譜峰的準確定量。這點(diǎn)對于單純通過(guò)質(zhì)荷比進(jìn)行分析的質(zhì)譜儀來(lái)說(shuō)完全無(wú)能為力。但是,這個(gè)看似不可能完成的任務(wù)卻被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。這是因為,不同于其它常見(jiàn)質(zhì)譜,沃特世的SYNAPT?質(zhì)譜平臺還具備根據離子大小及形態(tài)進(jìn)行分離的功能(行波離子淌度分離)。在數據處理時(shí),除多肽離子的質(zhì)荷比信息外,還可以通過(guò)離子遷移時(shí)間(離子淌度維度參數)將不同離子區分。因此這種SYNPAT獨有的被命名為HDMSE的質(zhì)譜分析技術(shù)可以將因質(zhì)荷比相同而重疊的多肽分離開(kāi),輕而易舉地解決了質(zhì)譜信號疊加的問(wèn)題,得到準確的交換率數據[11,12](圖2)。SYNPAT質(zhì)譜平臺一經(jīng)推出就奪得了2007年P(guān)ITTCON金獎,目前已經(jīng)推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型號,并具備ESI、MALDI等多種離子源。除氫氘交換技術(shù)外,SYNAPT質(zhì)譜系統在蛋白質(zhì)復合體結構研究中也是獨具特色,已有多篇高質(zhì)量應用文獻發(fā)表[13,14,15]。
實(shí)現氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)的第四個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),是如何高效分析實(shí)驗產(chǎn)生的多時(shí)間點(diǎn)及多次重復帶來(lái)的大量數據。人工完成如此巨大的信息處理工作,將消耗科學(xué)家大量的時(shí)間。沃特世氫氘交換質(zhì)譜解決方案所提供的DynamX軟件可以為科學(xué)家提供簡(jiǎn)便直觀(guān)的分析結果,并包含多種呈現方式。
 
在某些特殊研究中,要求對蛋白氫氘交換位點(diǎn)做到精確到氨基酸的測量,這是氫氘交換質(zhì)譜研究的又一個(gè)難點(diǎn)。在常規的研究中采用CID(碰撞誘導解離)碎裂模式,可能導致氘原子在多肽內重排,而致使不能對發(fā)生交換的具體氨基酸進(jìn)行精確定位。SYNPAT質(zhì)譜提供的ETD(電子轉移解離)碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混亂,并具有良好的碎裂信號[16]。
沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System為氫氘交換質(zhì)譜實(shí)驗提供了前所未有的簡(jiǎn)易的解決方案,強有力地推動(dòng)了氫氘交換技術(shù)在蛋白質(zhì)結構及動(dòng)態(tài)變化研究、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)發(fā)現、蛋白表位以及活性位點(diǎn)鑒定方面的應用,正在成為眾多結構生物學(xué)科學(xué)家和生物制藥企業(yè)必不可少的工作平臺。
 
編輯:songjiajie2010

 
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