不同的細(xì)菌,或者由于觀察者所側(cè)重觀察的內(nèi)容不同一,所以所使用的染料也有差異,但是簡(jiǎn)單染色的方法是一樣的。先按照上述的制片方法制片,制成需要觀察的玻片后,使用相對(duì)應(yīng)的染料滴加到玻片上菌膜區(qū)域,以覆蓋菌膜為準(zhǔn)。按照不同染料的要求,結(jié)合所觀察的內(nèi)容確定染色時(shí)間,染色時(shí)間到達(dá)時(shí),進(jìn)行水洗,干燥等步驟(見(jiàn)圖5-2)。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進(jìn)行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進(jìn)行油封、蠟封等封片過(guò)程。
二、芽孢染色法
芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬的細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子,這些孢子耐高溫、干旱及有毒化學(xué)試劑。內(nèi)孢子還能抵制細(xì)菌染色液的進(jìn)入,在革蘭氏染色法涂片染色時(shí),革蘭氏陽(yáng)性菌的芽孢呈現(xiàn)無(wú)色。然而,芽孢一旦著色后就很難脫色。
雖然芽孢通?稍诟锾m氏染色片中看到(芽孢由于不易讓染料進(jìn)入多呈現(xiàn)無(wú)色),但在不易清晰觀察時(shí),可用特殊的芽孢染色法,使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色,更便于觀察。其實(shí)驗(yàn)的操作方法與革蘭氏染色類似。主要的芽孢染色法有以下兩種。
(一)孔雀綠染色法
(1)將生有芽孢的斜而菌苔按革蘭氏染色法涂片后,用飽和孔雀綠水溶液(約為
7.6%)染10 min。
(2)用自來(lái)水沖洗。
(3)用0.5%番紅液復(fù)染30%.
(4)水洗,吸干。
(5)鏡檢:芽孢呈綠色,菌體和芽抱囊呈微紅色,但應(yīng)注意菌體中有異染粒時(shí),也可呈綠色。
(二) 石炭酸復(fù)紅染色法
(1)按常規(guī)涂片。
(2)滴加石炭酸復(fù)紅于涂片上,并于玻片下緩緩加熱,使染液冒蒸氣但不沸騰,并繼續(xù)滴加染液,不使涂片上染液蒸干,這樣保持5 min。
(3)涂片冷卻后,傾去染液,用酸性乙醇脫色至無(wú)紅色染劑洗脫為止。
(4)徹底水洗。
(5)用呂氏美藍(lán)復(fù)染2 min -3 min。
(6)水洗、吸干。
(7)鏡檢:鏡檢時(shí),菌體及孢囊呈藍(lán)色,芽孢呈紅色。
具體實(shí)驗(yàn)時(shí),在對(duì)一些特殊芽孢染色時(shí),需要對(duì)染色液和復(fù)染液進(jìn)行修改。
三、鞭毛染色
鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官,非常纖細(xì),直徑一般為10nm~20 nm,超出了光學(xué)顯微鏡的觀察極限,因此通常情況下在顯微鏡下觀察不到鞭毛。通過(guò)使用特殊的染色技術(shù),可以將染色液附加到鞭毛的周圍,增加它的直徑,從而能夠在光學(xué)顯微鏡下觀察到鞭毛,而且能檢測(cè)鞭毛在細(xì)菌中的分布。尤其是鞭毛染色可用于區(qū)分假單胞菌科的一些有兩極鞭毛的細(xì)菌和腸桿菌科有周身鞭毛的細(xì)菌(在運(yùn)動(dòng)時(shí))。
鞭毛十分細(xì)小,很容易從細(xì)菌上脫離,所以要得到非常滿意的鞭毛染色玻片十分困難。另外,很多染色方法會(huì)產(chǎn)生沉淀物,這又使得觀察鞭毛十分困難。
鞭毛染色一般分為兩類:一種是銀鹽法,使銀在鞭毛上堆積;另一種是使用復(fù)紅沉積在鞭毛上。
(一)銀鹽沉積法(改進(jìn)的Fontana方法)
應(yīng)使用絕對(duì)干凈(無(wú)油脂)的載玻片進(jìn)行染色,最好是新的無(wú)油載玻片。用過(guò)的載玻片要在酪酸洗液中浸泡,并用蒸餾水沖洗干凈后方可再次使用。
細(xì)菌在瓊脂斜面上,比最佳生長(zhǎng)溫度低3℃~5℃的溫度下培養(yǎng),可在斜面上加1滴~2滴滅菌的生理鹽水保持濕度。
(1)將載玻片在火焰上快速灼燒5s,放在染色架上冷卻,用蠟筆分成兩個(gè)區(qū)域(用鑷子夾住載玻片的一端)。
(2)用移液管或巴斯德移液管移取2mL無(wú)菌水加入到幼齡(通常為18 h)、生長(zhǎng)活躍的斜面菌株中,慢慢振蕩并旋轉(zhuǎn)試管使菌株懸浮。建議盡量避免使用接種環(huán)。然后轉(zhuǎn)移到干凈的試管中,通過(guò)懸滴試驗(yàn)檢查菌體的運(yùn)動(dòng)性。用無(wú)菌水將懸浮液稀釋至略有渾濁為止。放入20 ℃ -30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,然后移取一滿環(huán)懸浮液加在已冷卻的載玻片一端。傾斜載玻片讓液滴流到蠟筆畫的中心線。在空氣中自然干燥,不要加熱玻片。
(3)用媒染色劑媒染5 min。
(4)慢慢用蒸餾水充分漂洗掉所有的媒染液。
(5)用熱的Fontana銀液覆蓋,染色5 min,每隔1 min更換1次染色液( Fontana銀液在沸水浴中加熱)。細(xì)菌涂層的每一部分都始終要浸在染色液中,不能裸露。
(6)用水沖洗,在空氣中晾干,鏡檢。
(二) Leifson替代染色法
下述Leifson鞭毛染色法可以代替上述方法的(3) ~(6)。
(1)滴加1 ml的Leifson鞭毛染色液,注意不要使染色液干燥,直到玻片上形成細(xì)微的鐵銹色沉淀(約10 min) 。
(2)慢慢地用蒸餾水充分沖洗干凈。
(3)用1%的亞甲基藍(lán)復(fù)染5 min ~10 min。
(4)用水洗凈,空氣中干燥,鏡檢。沒(méi)有復(fù)染時(shí),細(xì)胞和鞭毛都呈現(xiàn)桃紅色,復(fù)染后,細(xì)胞染成藍(lán)色,鞭毛染成紅色。
實(shí)驗(yàn)中需要注意的是鞭毛很容易脫落,若觀察時(shí)視野中大多為周身鞭毛細(xì)胞,說(shuō)明該菌是周毛菌,但若觀察到一個(gè)明顯的極端鞭毛細(xì)胞時(shí),并不一定說(shuō)明不是周毛菌。
注意事項(xiàng):
(1)適宜的培養(yǎng)基、溫度和通氣條件下,以短期內(nèi)多次連續(xù)接種培養(yǎng)的幼齡菌種鞭毛情況最好。因此,用于鞭毛染色的菌種常常用幼齡菌,菌齡老化或某些培養(yǎng)條件變化常導(dǎo)致鞭毛脫落或喪失。
(2)玻片應(yīng)清潔無(wú)油污。鞭毛非常纖細(xì)且容易脫落,故操作過(guò)程動(dòng)作要輕。
(3)染色法的染料須當(dāng)日配制, 4 h內(nèi)效果最好。所以鞭毛染色液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
四、莢膜染色
莢膜是某些細(xì)菌在新陳代謝過(guò)程中形成的,分泌于細(xì)胞壁外的一層膠狀黏液性物質(zhì),主要化學(xué)成分是多糖類物質(zhì)。莢膜的折光性低,易溶于水,與染料親和力低,但莢膜的通透性比較好,某些染料可透過(guò)莢膜而使菌體著色。因此染色后在菌體周圍有一淺色或無(wú)色的透明圈,即為莢膜。一般采用負(fù)染色的方法,使背景與菌體之間形成一透明區(qū),將菌體襯托出來(lái)便于觀察分辨,故又稱襯托法染色。因莢膜薄,且易變形,所以不能用加熱法固定。
具體操作步驟(見(jiàn)圖5-8)。
(一)制片
加1滴6%葡萄糖水溶液于載玻片一端,無(wú)菌操作,挑取細(xì)菌斜面上培養(yǎng)72 h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合。
(二)推片法制片
加1滴墨汁充分混勻。用推片法制片,將菌液鋪成薄層, 自然干燥。
(三)固定
滴加1滴~2滴無(wú)水乙醇覆蓋涂片,固定1 min, 自然干燥;也可以不加處理, 自然干燥。
注意:不能用火加熱干燥。
(四)結(jié)晶紫染色
在已自然晾干的涂面上,滴加1%結(jié)晶紫染色液染色。
(五)沖洗
2 min后,以20%硫酸銅沖洗數(shù)次。再用自來(lái)水沖洗1次。
(六)拭干水分后鏡檢
用擦鏡紙拭干水分后鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色,背景灰黑色,莢膜不著色呈無(wú)色透明圈。無(wú)莢膜的菌,由于干燥菌體收縮,菌體四周也可能出現(xiàn)一圈狹窄的不著色環(huán),但這不是莢膜,莢膜不著色的部分寬。
五、死活染色
在顯微鏡下活細(xì)胞細(xì)胞膜完整、立體感強(qiáng),細(xì)胞質(zhì)透明度好,顆粒狀物質(zhì)少;死細(xì)胞膜破裂,無(wú)立體感,細(xì)胞通透性差,有顆粒狀物質(zhì)、空泡。
染色排除法是生物研究中判斷細(xì)胞活性的一種常用方法,簡(jiǎn)便,易于操作,實(shí)驗(yàn)是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異來(lái)進(jìn)行的。原理:因?yàn)榛罴?xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇透過(guò)性,細(xì)胞不需要的物質(zhì)通常不進(jìn)入細(xì)胞,染色劑中如臺(tái)盼藍(lán)能進(jìn)入死細(xì)胞,從而可以使死細(xì)胞染色。依此染色便可以判斷細(xì)胞的活性。
活細(xì)胞必須要通過(guò)控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞膜來(lái)保持內(nèi)部生理環(huán)境的穩(wěn)定性。細(xì)胞死后,細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變,原先不能進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)也能夠進(jìn)入細(xì)胞。常見(jiàn)的細(xì)胞染料有:中性紅、臺(tái)盼藍(lán)、甲基藍(lán)、美藍(lán)、熒光素雙乙酸酯等。臺(tái)盼藍(lán)染料正常情況下被活細(xì)胞攔在細(xì)胞膜外,只有細(xì)胞膜受損或者細(xì)胞死亡后,才能進(jìn)入細(xì)胞,從而與解體的DNA結(jié)合,使其著色,因此,活細(xì)胞一般不被臺(tái)盼藍(lán)染色,而死細(xì)胞會(huì)被染成藍(lán)色。通過(guò)顯微鏡觀察很容易識(shí)別出死亡的染色細(xì)胞,并可用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
用美藍(lán)染色液可以對(duì)酵母菌細(xì)胞進(jìn)行死活染色鑒別。美藍(lán)是一種弱氧化劑,氧化態(tài)呈藍(lán)色,還原態(tài)呈無(wú)色;畹慕湍敢?yàn)樾玛惔x不斷進(jìn)行,具有一定的還原能力,能將進(jìn)入細(xì)胞的美藍(lán)還原,而細(xì)胞不染色。因此,用美藍(lán)對(duì)酵母細(xì)胞染色一定時(shí)間后,無(wú)色的為活細(xì)胞,藍(lán)色的為死細(xì)胞。需要注意的是:一個(gè)活細(xì)胞的還原能力是有限的,必須嚴(yán)格控制染色的時(shí)間和染料的濃度。
方法:取0.1%美藍(lán)液一滴,滴在玻片中央,加一滴酵母菌懸液,混勻。染色3 min ~5 min后,加蓋片制成水浸標(biāo)本片,即可鏡檢,這種方法也適用于細(xì)菌和霉菌。